医疗产品设计:CRISPR基因编辑揭开面纱崭露头角

CRISPR是英文Clustered regularly interspaced short palindromic repeats的缩写,中文意思是成簇的、有规律间隔的短回文重复序列,简单点就是基因序列编辑器,是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术。

下面简单介绍下CRISPR这个神仙技术的简史。

CRISPR的发现及其功能

1993年报道,弗朗西斯科·莫吉卡(Francisco Mojica)是第一个描述现所谓的CRISPR基因座的研究者。2000年,他发现完全不同的重复序列其实是具有一组共同的特征,即现在已知的CRISPR序列的特征,在2002年首次在印刷品中使用了CRISPR一词。

Cas9和PAM的发现

2005年5月,Bolotin正在研究嗜热链球菌的细菌,它刚刚被测序,揭示了一个不同寻常的CRISPR位点。尽管CRISPR阵列与先前报道的系统相似,但它缺少一些已知的cas基因,而含有新的cas基因,其中一个基因编码是他们预测具有核酸酶活性的大蛋白,即现在所知的Cas9。此外,他们还指出,与病毒基因有同源性的间隔区,在一端都有一个共同的序列。这个序列,原间隔基序(PAM)是目标识别所必需的。

自适应性免疫假设方案

2006年3月,Eugene Koonin通过计算分析研究一组同源蛋白质,并提出了一个假设方案,将CRISPR级联作为细菌免疫系统,其基于与噬菌体DNA同源的插入物,推翻了先前关于Cas蛋白可能包含一个新的DNA修复系统的假设。

自适应免疫的实验演示

2007年3月,科学家们想通过噬菌体来制造酸奶,并在乳制品工业中广泛使用。Horvath和他的同事通过实验证明了CRISPR系统确实是一个适应性免疫系统。此外,他们还发现Cas9可能是干扰所需的唯一蛋白质,CRISPR系统通过这个过程使入侵的噬菌体失活。

间隔子序列被转录为指导RNA

2008年8月,约翰·范德奥斯特等科学家们开始详细说明CRISPR-Cas系统是如何“干扰”入侵的噬菌体的。他们指出在大肠杆菌中,源于噬菌体的间隔序列被转录成小RNA,称为CRISPR RNAs,引导Cas蛋白质到达目标DNA。

CRISPR作用于DNA靶

2008年12月-Luciano Marrafini和Erik Sontheimer,他们证明了目标分子是DNA,而不是RNA。许多人认为CRISPR与真核生物的RNA沉默机制类似,后者以RNA为靶点。marrafini和Sontheimer在他们的论文中明确指出,如果这个系统能够被转移到非细菌系统中,那么这个系统将是一个强大的工具。

Cas9切割目标DNA

2010年12月,Moineau和他的同事证明CRISPR-Cas9在精确的位置,即PAM上游的3个核苷酸处,在靶DNA中产生双链断裂。他们还证实了Cas9是CRISPR-Cas9系统中进行切割所需的唯一蛋白质。

发现用于Cas9系统的tracrRNA

2011年3月,关于自然CRISPR-Cas9引导的干扰机制的最后一个难题来自Emmanuelle Charpentier。他们对化脓链球菌进行了小RNA测序,该链球菌具有含Cas9的CRISPR-Cas系统。他们发现除了crRNA外,还存在第二个小RNA,他们称之为反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)。他们表明tracrRNA与crRNA形成双链体,而正是这种双链体将Cas9引导至其靶标。

CRISPR系统可以在其他物种中异源发挥作用

2011年7月,Siksnys和同事从嗜热链球菌(II型系统)克隆了整个CRISPR-Cas基因座,并在大肠杆菌(不包含II型系统)中表达了这一点,他们证明了它能够提供质粒抗性。这表明CRISPR系统是独立的单元,并证实II型系统的所有必需组件都是已知的。

Cas9介导的裂解的生化表征

2012年9月,利用异源系统, Siksny和他的团队从大肠杆菌携带嗜热杆菌CRISPR基因的大肠杆菌菌株中,用crRNA与crRNA复合纯化了Cas9,并进行了一系列生化实验,以表明Cas9的作用模式,他们验证了PAM的裂解位点和要求,并使用点突变,他们显示RuvC域切割非互补链,而HNH域切割互补位点。他们还指出,crRNA可以缩减到20 nt的伸展,足以有效切割。

CRISPR-Cas9用于基因组编辑

2013年1月,麻省理工学院麦戈文脑研究所的张峰在其他基因组编辑系统上工作,他是第一个成功地将CRISPR-Cas9用于真核细胞基因组编辑的人。张先生和他的团队设计了两种不同的Cas9同源序列(来自嗜热链球菌和化脓链球菌),并在人和小鼠细胞中展示了靶向基因组切割。从那时起,研究人员发现CRISPR/Cas9具有惊人的多功能性。科学家们不仅可以利用CRISPR将基因剪除,从而“沉默”,还可以利用修复酶将所需的基因替换到狙击手留下的“洞”中。

CRISPR基因编辑技术,自诞生以来短短几年时间内,已成为近年来生命科学领域最耀眼、最受关注的技术,也一直被视为诺贝尔奖的有力竞争者。

科学家们用人工RNA来切割Cas9蛋白。这种酶会搜索任何具有相同代码的目标,而不仅仅是病毒,然后开始切割。在2012年一篇具有里程碑意义的论文中,Doudna、Charpentier和martinjinek展示了他们可以使用CRISPR/Cas9系统在任何他们想要的地方切割任何基因组。

基因编辑本身并不新鲜。编辑基因的各种技术已经存在多年了。CRISPR之所以如此具有革命性,是因为它是非常精确,Cas9酶通常随您所愿而行。而且它非常便宜且容易,过去,改变一个基因可能要花费数千美元以及数周甚至数月的操作。现在,它的价格可能仅为75美元,并且只需几个小时。

CRISPR,是原核生物的自我防御系统,检测特定的致病核酸,干扰外源DNA的功能,保护它们免受外来入侵。近年来,CRISPR因其特有的等位基因特异性在体外诊断领域吸引了越来越多的关注,对癌基因突变和单核苷酸变异检测方面具有潜在诊断能力。

基于CRISPR / Cas的体外诊断

基于CRISPR‐Cas的体外诊断平台已经取得了快速发展,可以检测和识别各种类型的致病因子。利用核酸是疾病有效生物标记的原理,基于CRISPR的诊断方法主要依赖于检测与疾病相关的特定序列,然后对其进行切割以产生可读信号。靶序列的实例包括致癌突变序列或源自感染因子的病毒和细菌序列。CRISPR系统的目标是识别特定的病原体,并通过在染色体的确切位置编辑特定的DNA序列来修复引起疾病的等位基因。

病毒诊断检测

病毒是一种微小的感染媒介,只能在活细胞中发挥其生物学功能。它们主要由遗传物质和蛋白质外壳组成。这些病毒颗粒的形状各异,它们以多种途径传播。现有的病毒检测方法通常是核酸扩增和检测工具,例如PCR,其主要依赖于热循环。尽管一次原始核酸的扩增和检测在某种程度上是敏感和可调节的,但病毒诊断的主要困难在于它们需要大量的样品处理和大量的机械设备。他们可能无法区分具有相似表型的相关病毒。

科学家通过CRISPR‐Cas13a开发了一种快速检测病毒的方法,该方法利用其附带的RNA降解功能。无需任何复杂的仪器,即可使用量油尺在不到一个小时的时间完成检测。

细菌诊断检测

细菌是迄今为止最小的活细胞,被归类为原核生物。以前通过在培养基中培养长达48小时来完成细菌的鉴定。之后,对培养的生物进行分析和观察以帮助识别菌株这种方法既费时又费力,因此科学家们呼吁使用快速,可靠,易于使用和廉价的诊断工具。Gootenberg等人使用基于CRISPR‐Cas13a的分子检测平台成功鉴定了引起人类疾病的致病变种的大肠杆菌和铜绿假单胞菌 。该分子诊断平台基于CRISPR‐Cas13a,通过重组酶聚合酶扩增(一种核酸的等温扩增)扩增DNA(或具有逆转录酶的RNA)。使用单一温度的等温扩增不需要专门的仪器。这种体外核酸检测方法被命名为SHERLOCK。

基于CRISPR-Cas的肿瘤诊断测试

癌症是一种细胞异常生长的疾病,可能侵袭人类各个部位。研究人员提出了一种基于CRISPR‐Cas9的检测DNA突变的方法,已证明CRISPR‐Cas9可以切割野生型基因组DNA。同时,由于microRNAs的表达模式与癌症有关,无细胞microRNAs在血液中绝对稳定,可用于体外诊断。科学家们开发了一种基于CRISPR-Cas9的microRNA检测方法,用于癌症诊断,通过RCA对miRNAs进行等温扩增,并与具有灭活核酸酶活性的Cas9突变体(dCas9)结合,用于导入特定的基因组位点,在编辑、成像等方面有着广泛的应用。

CRISPR优缺点

CRISPR的方法比PCR具有更多优势,包括更短的检测周期,等温信号放大(无需热循环),单核苷酸靶标特异性,无需复杂的仪器等。CRISPR系统具有独特的能力,可以迅速地重组来诊断由新发病毒引起的传染病。基于CRISPR的快速诊断解决方案能够精确检测冠状病毒家族成员的突变菌株。因为在流行病学研究中快速,及时地检测感染者中的病毒非常重要,因此有必要开发出控制病毒扩散的诊断方法。除此之外,能够检测无症状感染以及病毒突变株也具有其重要性。

用于设计CRISPR中的指导RNA的序列是从菌株之间的保守区域中选择的,所以即使病毒发生突变,基于CRISPR-Cas的诊断测试也能够检测到它。由于该测试是基于病毒基因组的诊断,因此可以在感染的任何阶段使用,尤其是在潜伏期的早期阶段检测,而无需进行其他确认性测试。而PCR测试是无法在感染后立即检测到病毒,需要时间来增加病毒的载量。因此在感染早期容易得到假阴性结果。

但是,CRISPR-Cas系统的主要缺点是sgRNA与被研究生物的基因组非特异性结合(脱靶现象),从而导致信号差和对结果的误解。

自从CRISPR基因组编辑和诊断工具出现以来,很多公司纷纷开始开发利用CRISPR技术的商业化IVD产品。

ITL是生命科学和体外诊断领域的技术和产品创新者,在激烈的市场环境下,凭借40多年的技术积淀和400多项IVD开发的成功经验能够根据客户和市场需求,灵活运用创新技术,为客户提供定制化的仪器开发和设计服务。ITL对诊断仪器的开发有自己独特的解决方案,产品开发时充分考虑其未来的使用场景和可用性,贯彻系统化的风险管理。我们的总部位于英国,并在美国和中国设立分公司,为全球医疗诊断客户提供一站式IVD产品开发服务。无论您的项目处于开发流程的任何阶段,我们都欢迎您前来交流和探讨。

您可能还喜欢...

News
英国ITL集团将参加医疗科技创新博览会

阅读更多 >

Resource
IVD产品开发:探索侧向流动技术的未来(下)

阅读更多 >

Case Study
微流控芯片和微缩芯片技术

查看此案例研究 >

Case Study
LumiPod

针对未来可应用于POCT产品中的新技术的演示项目。

查看此案例研究 >